基因检测
基因检测
产前基因诊断的最早形式
产前基因诊断的最早形式

  爱德华兹和加德纳在1968年提出了植入前遗传学诊断的概念,尽管直到胚胎学和遗传学诊断使单细胞检测成为可能之前,临床应用才是可能的。1990年报道的第一例病例利用PCR来确定处于X连锁疾病风险中的夫妇的胚胎性别。今天,通过使用PCR或FISH技术,PGD可用于检测单基因缺陷,结构染色体异常和非整倍性。最初提出PGD的目的是仅植入遗传上正常的胚胎,从而避免后来的胎儿异常胎儿的产前诊断和终止妊娠的必要性。最近,已经对不育症患者进行了PGD研究,以此作为通过增加植入和降低自然流产率来提高辅助生殖技术成功的方法。关注卡马替尼的肿瘤基因检测网将介绍PGD方法的描述,有关其使用的现有文献的摘要,并确定随着该技术的使用变得越来越广泛而应考虑的该技术的可能的优点和缺点。
   关于PGD程序存在几个突出的问题。首先,它要求患者接受体外受精进行抗逆转录病毒治疗。其次,它需要对发育中的胚泡或卵母细胞的极体进行活检。最后,只能去除少量遗传物质,通常仅从1或2个细胞中去除。这些关键点可以帮助指导临床医生和患者考虑PGD的适应症,伦理和其他注意事项。目前,由于PGD通常不作为孕前护理甚至是ART的一部分提供,因此,由于遗传原因,多次ART失败或通过自我转诊,都将考虑患者。对接受PGD治疗的患者进行彻底的评估和咨询,包括完整的遗传病史和对PGD适应症的询问。考虑单个基因缺陷的PGD的夫妇必须解该程序的风险,包括误诊的风险。实验室必须确认可以对所关注的疾病进行测试,并且可以在单个细胞上进行测试。在一对考虑对家族易位进行染色体分析的夫妇中,必须与该夫妇进行类似的风险评估并进行讨论,并进行安排以获取或产生可识别目标染色体区域的DNA探针。
   PGD活检最常见于第3天的胚胎,在8至16个细胞阶段取出或分析1或2个细胞。胚胎的所有细胞都保持全能,直到发育的第4天。取出1个细胞进行分析可能会在短时间内延迟胚胎发育,但已证明正常发育会继续。一组报告说,只有0.9%的胚胎在其机构的活检过程中受到了破坏。迄今为止,没有明确的证据表明活检的胚胎的植入频率要低于未进行活检的胚胎。然而,为了减少误诊,已经描述了在胚胎活检时去除2个细胞。尽管一项回顾性研究表明1细胞活检和2细胞活检的胚胎的植入率没有差异,但仍然存在这样的差异。除了胚泡,卵母细胞的极体也可以在体外进行活检。第一和第二极体分别反映卵母细胞的互补染色体和姐妹染色单体。这些可以用来推断胚胎的染色体状态。但是,极体不包括父系贡献,因此不能排除父系遗传性疾病或非整倍性。用于囊胚活检的分子技术也可用于具有许多相同限制的极体。尽管一些研究表明在ART中极体分析方面取得了成功,但大多数研究都报告了使用第3天胚胎的情况。
   由于必须以对时间敏感的方式将胚胎植入子宫,因此需要通过PCR或FISH进行快速分析。对于单基因研究,PCR用于扩增特定的DNA片段,然后可以使用标准分析技术分析突变的DNA。通过这种技术至少可以诊断出30种不同的疾病。FISH用于鉴定染色体异常。该技术利用荧光染料标记的DNA探针,该探针与特定于单个染色体区域的DNA序列互补。使用的探针的类型和数量取决于指示。每个染色体至少可以使用一个FISH探针,但是由于有限的可用荧光染料以及由于重叠而造成误诊的风险,因此只能将有限数量的FISH探针同时应用于单个相间核。最新的协议允许使用两组DNA探针对细胞进行分析,一组随后进行另一组DNA探针,从而允许在与标准IVF兼容的时间范围内同时分析多达10条或更多条染色体。
   FISH诊断的数字限制导致对几种技术的研究,这些技术允许及时分析适合ART的完整染色体数。一种方法是使用光谱核型或常规核型将细胞转变为中期后从卵裂球中分析染色体。核型染色体是有问题的,因为核仅在整个细胞周期的小部分处于中期。可以通过使用有丝分裂抑制剂将细胞阻滞在中期,但是这会导致难以分类的染色体缩短。最近,分子技术已用于扩增整个基因组,然后使用比较基因组杂交或定量荧光技术进行定量分析。这些技术具有广阔的前景,但目前仍处于研究阶段。PGD的目的是在植入前鉴定染色体或基因异常,从而降低胎儿中这些异常的风险以及通过羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样诊断后终止受影响的胎儿的潜在需求。最初,PGD被引入具有遗传性疾病后代风险的患者中使用,通常其复发风险为25%至50%。FISH的发展也允许在易位携带者的父母中进行测试。最近,非整倍体鉴定不仅已用于非整倍体后代的高风险女性中,而且还被用作提高反复流产或IVF失败女性的生殖效率的手段。更具争议性的是,PGD在偏爱特定性别儿童的夫妻中进行性别选择,在有兄弟姐妹需要骨髓移植的夫妻中进行HLA分型以及用于检测迟发性疾病,例如阿尔茨海默氏病。
   PGD用于X连锁疾病的研究最早于1990年发表。在此报告中,使用PCR检测Y染色体特异性重复序列的胚胎被确定为雌性该序列被转移到2名有传播X连锁疾病风险的患者中。最近,改进的技术允许直接检测X连锁中的致病性DNA突变以及常染色体隐性和显性疾病。家族中几乎已经鉴定出突变的任何单基因疾病都适合于PGD。如果尚未鉴定出直接的基因突变或不适合单基因分析,则也可以进行连锁分析。当亲本携带平衡的重排,例如易位和倒位时,PGD也可用于检测胚胎中的染色体结构异常。在这种情况下,PGD的目标既是减少自然流产的发生率,又是使分娩不平衡核型儿童的风险降到最低。在罗伯逊易位的情况下,PGD相对简单,因为仅需最少的双色FISH,且每个染色体都有一个探针。相互易位的PGD更复杂,因为每个家庭通常都有独特的易位。三色FISH分析通常使用探针针对一条染色体上的断裂点的任一侧以及另一条染色体上的任意点进行。识别特定情侣所需的探针可能既困难又耗时。此外,将探针的着丝粒和端粒结合到断点上,可以使胚胎携带不平衡的蛋白质。染色体补体与健康的有区别,但不能区分没有易位的胚胎和携带平衡易位的胚胎。
   非整倍性风险增加的任何一组患者都有可能从PGD中受益,这是一种较早的产前诊断形式。最常见的人群包括35岁或以上的女性,其受孕非整倍体胚胎的风险增加。最近,一项对无生命的三天胚胎的研究表明,在34岁或以下的女性中非整倍性率为1.4%,在40岁以上的女性中为52.4%。从理论上讲,患者可以通过利用PGD并仅植入确定为整倍体的胚胎来避免焦虑和产前诊断的风险。由于在产前诊断或分娩时非整倍性的风险相对较低,即使在“孕妇年龄”人群中,也很难证明这种益处。随着体外受精的成功率随着产妇年龄的增长而降低,PGD也可能使老年不育患者受益。在40岁以上接受捐赠卵子的妇女中,植入率的提高表明,随着母亲年龄的增长,植入率下降的主要原因是卵母细胞的问题而不是宫内环境的问题。因此,鉴定和利用PGD的染色体正常胚胎可以改善植入,并最终提高老年妇女的持续妊娠率。尽管数据有限,但研究表明,在该人群中,使用非脱倍体筛查的PGD抗逆转录病毒治疗成功率增加。需要进行进一步的研究以证明PGD可以提高IVF成功率的年龄超过什么年龄。一些作者建议,在37岁以后,这种好处可能会证明对接受IVF的患者常规地提供这种选择是合理的。
   PGD也被认为对反复流产或IVF衰竭的患者有益。研究集中在以下假设上:如果此类患者的染色体异常胚胎发生率很高,那么通过PGD选择正常胚胎应该会导致ART的成功率更高和流产次数更少。尽管近50%的反复流产病例病因不明,但仍有50-83%的流产是染色体异常。进一步,与年龄相匹配的对照组相比,已经证明了具有反复流产史的患者异常胚胎的百分比增加。但是,这些研究没有显示出在此类患者中使用PGD时,植入率或正在进行的妊娠率均没有显着增加。关于PGD对IVF复发失败患者的益处的数据是矛盾的。在这种情况下进行的三项针对PGD的早期研究表明,在该人群中使用PGD并没有改善结局。然而,最近的一项研究不仅发现IVF复发失败患者组中异常胚胎的比例显着更高,而且实现植入率IVD失败史的患者使用PGD诱惑与年轻,健康的对照者相似。
   从以上总结可以明显看出,PGD可以提供早期诊断的潜在好处,而不会使植入的妊娠处于危险之中。尽管PGD可能是羊膜腔穿刺术和绒毛膜绒毛取样的一种很好的选择,尽管成本很高,但对胚胎的损伤,诊断的准确性以及妊娠结局的担忧仍然是重要的考虑因素。标准的产前诊断涉及测试相对大量的DNA。仅分析PGD中的1或2个细胞所涉及的复杂性就存在误诊的可能性,这可能是由于PCR或FISH分析的技术难题以及马赛克所致,其中所分析的细胞不代表其余部分的遗传组成。总体而言,据报道单基因疾病的PGD的错误率为5-10%。错误的诊断可能是由于父本或母本的影响或一个等位基因的优先扩增引起的样品污染,如扩增单个细胞时可能发生的。可以通过使用胞浆内精子注射来克服由于受精受精卵表面残留的过多精子而引起的父体污染,建议在进行PGD时建议使用。产妇的污染主要来自卵丘细胞的干扰,因此更难克服。在基于PCR的PGD分析中结合使用链接的或未链接的多态性标记应减少由于污染引起的误诊风险。当一个等位基因在扩增过程中未能扩增时,也可能导致PCR的误诊。这种现象被称为等位基因缺失,在极端情况下可能会影响超过20%的扩增。已经开发了几种较新的技术,例如多重PCR,以减少等位基因的缺失并提高PGD的准确性。
   用于检测不平衡易位或非整倍性的FISH分析也存在一些误诊的可能性。由于信号故障或重叠,FISH技术的错误可能高达15%。文献中提出的减少FISH误差的方法包括使用产生较大固定核的扩散技术,限制FISH的轮数,使用探针的单色标记[39]以及同时分析2个或多个基因座来自同一条染色体。由于镶嵌术导致的PGD的误诊率很难评估,因为它只能通过分析尚未用于ART的胚胎中的每个细胞来确定。据报道,马赛克引起的误诊率从5%到9%。这种误诊可能是假阳性或假阴性,分别导致丢弃正常胚胎或植入异常胚胎。仅当两个都正常的情况下,才需要对2个具有胚胎移植的细胞进行活检,可以降低因镶嵌术引起的误诊的风险,但是,尽管误诊的可能性有所降低,但仍然存在。
   有关PGD误诊的最新数据来自2002年欧洲人类生殖与胚胎学学会PGD联盟的第三份报告。报告451例怀孕中的8例误诊的详细信息:5例是使用PCR导致的和3个是由于使用了FISH而引起的,其中包括1个三体性21,1个易位和1个不正确的性别识别。最近,进行和研究PGD的三个最大的中心报告了他们在过去10年中的错误诊断。在754例活产婴儿中,他们报告有5例误诊。从伦理上讲,将PGD与标准IVF进行比较的随机试验将很困难,并且通常无法获得此类数据。但是,迄今为止,有两个相对较大的多中心队列研究。通过26个PGD的指示来报告信息向ESHRE联盟提供数据的中心。临床怀孕导致:在进行结构染色体异常测试后,有368人中的62人,在性别识别后测试254人中的254人中的41人,在进行单基因疾病测试后的575人中有119人。据报道,总共有799个周期的PGD用于非整倍性筛查,有199个因高龄孕妇,反复IVF失败或反复流产而导致ART预后不良的患者导致临床妊娠。
   国际植入前遗传工作组报告说,从90年代初到2001年进行的3,000个PGD周期中,妊娠率为24%。就妊娠和生育参数而言,从这些PGD周期中出生的700名儿童与注射胞浆内精子后出生的儿童相当。根据目前可获得的数据,PGD后的妊娠率似乎与所有患者IVF周期的预期成功率20-25%相当。在过去的十年中,努力提高胚胎的选择标准,活检技术和分析技术的准确性,已使PGD的成功率不断提高。在后代中患有严重的,使人衰弱的遗传性疾病的风险为25%至50%的患者中,关于PGD的适用性几乎没有道德上的争论。但在使用抗逆转录病毒疗法的患者中,其使用量增长最快,在这种情况下,关于这种昂贵技术的适用性和实用性存在更多疑问。PGD越来越多的可用性和新用途的出现,引起人们对正在接受分析的胚胎的治疗和权利以及产生“设计者”儿童的后果的担忧。关于PGD中选择和丢弃胚胎的争论与关于堕胎的争论相似。那些认为胚胎是有权利的人反对任何形式的PGD。其他人则认为,胚胎的发育不足以拥有利益或权利,但它们应作为人类的先驱而受到特别的尊重。基于此观点,PGD用于医学适应症时可能是可以接受的,但对于性别选择而言则是不可接受的。
   其他道德问题是结果论者。随着时间的流逝,特质的选择将导致充满设计儿童的优生世界。支持的人PGD的使用表明,已经选择健康的后代,无论是在视觉上选择健康出现的胚胎以植入ART还是通过传统的产前诊断进行染色体分析,因此,PGD不应作为目标并加以限制。PGD也已被用来在后代中选择特定的HLA类型,以向兄弟姐妹提供骨髓。显然,这里的道德问题更加复杂。为患有白血病或某些遗传性疾病的孩子提供与HLA匹配的同胞可能会挽救生命。但是,反对这种做法的人认为,这种做法将儿童当作商品使用,并且违反了康提的要求,即永远不应将人用作手段。PGD还可以用于检测导致成年后期疾病或外在变化不完全的疾病的基因突变。在诸如亨廷顿氏病等疾病中,有100%的衰弱性致死性疾病的外显性,并且不进行治疗,一些患者要求进行所谓的保密PGD。受影响的父母不希望知道自己的身份,因此在不了解基因检测细节的情况下进行了PGD。为了确保不公开,这意味着即使亲本不受影响也要进行PGD,并且在没有未受影响的胚胎的情况下,进行假转移。由于围绕保密PGD的道德和经济问题,一些中心鼓励进行排他性测试。在这种策略中,连锁被用于从受影响的祖父母中排除携带染色体的胚胎,而不会透露患者的状况。
   PGD最具争议的用途之一是出于非医学原因而选择性别。那些反对这种做法的人指出,这种可能性可能会延续性别定型观念,并有可能导致中国人口性别比的差距。另一些人则认为,在一个拥有头胎的男子在经济和文化上都很重要的社会中,禁止使用该头胎会导致不必要的堕胎。一些支持这种做法的人将第一次怀孕时的性别选择与“家庭平衡”区分开来,以允许第二次怀孕时生下异性恋的孩子。ASRM在2001年发表立场声明,指出先孕前的性别选择对于性别多样化而言是可以接受的,但对于第一个孩子而言是不可接受的。然而,除预防X连锁遗传综合症外,出于其他任何目的的性别选择仍存在争议。关于获得这种昂贵技术的伦理问题也存在。目前,有能力负担PGD的患者通常无法获得保险,因此他们可能会他们自己决定是否要为此付出额外费用。这重新审视仅基于支付能力是否应该有区别地获得医疗技术的伦理困境。此外,作为一个社会,可能会发现上面讨论的异议足够强烈,以至于无论其支付能力如何,都限制他们使用PGD的机会。当然,随着这项技术变得越来越广泛,有必要解决这些问题。
   PGD为患者提供在怀孕之前进行基因检测的机会。它可以使患者避免就终止妊娠以及羊膜腔穿刺术和绒毛膜绒毛取样带来的流产风险做出决定。但是,该程序存在误诊和错误保证的风险,目前无法避免。尽管已经使用了十多年,但全世界的尝试周期数仅为6,000个,大约有1,000次怀孕。因此,就短期和长期妊娠结局而言,囊胚活检的其他风险需要进一步调查。最后,随着PGD的使用越来越广泛,医师,科学家,伦理学家和患者应系统地解决有关其使用的伦理问题。此类小组还应解决有关成本和可用性的其他问题,以将实验技术的使用仅限于那些适应症最强的人。

 
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